IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) нь β-галактозидазын субстратын аналог бөгөөд индукц өндөртэй байдаг.IPTG-ийн индукцийн дор индуктор нь дарангуйлагч уурагтай нэгдэл үүсгэж, улмаар дарангуйлагч уургийн бүтэц өөрчлөгдөж, зорилтот гентэй нэгтгэх боломжгүй болж, зорилтот генийг үр дүнтэйгээр илэрхийлдэг.Тэгэхээр туршилтын явцад IPTG-ийн концентрацийг хэрхэн тодорхойлох вэ?Том байх тусмаа сайн уу?
Эхлээд IPTG индукцийн зарчмыг ойлгоцгооё: E. coli-ийн лактозын оперон (элемент) нь β-галактозидаза, нэвчилт, ацетилтрансферазыг тус тус кодлодог Z,Y, A гэсэн гурван бүтцийн генийг агуулдаг.lacZ нь лактозыг глюкоз ба галактоз эсвэл алло-лактоз болгон гидролиз болгодог;lacY нь хүрээлэн буй орчинд байгаа лактозыг эсийн мембранаар дамжуулж, эс рүү орох боломжийг олгодог;lacA нь ацетил бүлгийг ацетил-КоА-аас β-галактозид руу шилжүүлдэг бөгөөд энэ нь хорт нөлөөг арилгадаг.Үүнээс гадна үйл ажиллагааны дараалал O, эхлэх дараалал P ба зохицуулах ген I байдаг. I генийн код нь операторын дарааллын O байрлалтай холбогдож чаддаг дарангуйлагч уураг бөгөөд ингэснээр оперон (мета) дарагдаж, унтраасан.Мөн P-ийн эхлэлийн дарааллын дээд талд катаболик генийг идэвхжүүлэгч уураг-CAP-тай холбогдох газар байдаг. P дараалал, O дараалал болон CAP-тай холбогдох газар нь нийлээд лак опероны зохицуулалтын бүсийг бүрдүүлдэг.Гурван ферментийн кодлох генүүд нь генийн бүтээгдэхүүний зохицуулалттай илэрхийлэлд хүрэхийн тулд ижил зохицуулалтын бүсээр зохицуулагддаг.
Лактоз байхгүй үед лак оперон (мета) нь дарангуйллын байдалд байна.Энэ үед PI промоторын дарааллын хяналтан дор I дараалалаар илэрхийлэгдсэн лак дарагч нь O дараалалд холбогддог бөгөөд энэ нь РНХ полимеразыг P дараалалтай холбохоос сэргийлж, транскрипцийн эхлэлийг саатуулдаг;лактоз байгаа үед лак опероны (мета) өдөөгдөж болно Энэ опероны (мета) системд жинхэнэ өдөөгч нь лактоз өөрөө биш юм.Лактоз нь эсэд нэвтэрч, β-галактозидазаар катализ болж, алоллактоз болж хувирдаг.Сүүлийнх нь өдөөгч молекулын хувьд дарангуйлагч уурагтай холбогдож уургийн хэлбэрийг өөрчилдөг бөгөөд энэ нь дарангуйлагч уургийг O дараалал, транскрипцээс салгахад хүргэдэг.Изопропилтиогалактозид (IPTG) нь аллолактозтой ижил нөлөө үзүүлдэг.Энэ нь маш хүчтэй өдөөгч бөгөөд нянгийн солилцоонд ордоггүй, маш тогтвортой байдаг тул лабораторид өргөн хэрэглэгддэг.
IPTG-ийн оновчтой концентрацийг хэрхэн тодорхойлох вэ?E. coli-г жишээ болгон авч үзье.
Эерэг рекомбинант pGEX (CGRP/msCT) агуулсан E. coli BL21 генийн инженерчлэлийн омгийг 50μg·mL-1 Amp агуулсан LB шингэн орчинд тарьж, 37°С-т нэг шөнийн турш өсгөвөрлөв.Дээрх өсгөвөрийг тэлэлтийн өсгөвөрт 1:100 харьцаатай 50мкг·мл-1 ампер агуулсан 50мл шинэ LB шингэн орчинд 10 лонхонд тарьж, OD600-ийн утга 0.6~0.8 болоход IPTG-ийг эцсийн концентрацид нэмсэн.Энэ нь 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0ммоль · L-1 байна.Ижил температурт, ижил хугацаанд индукц хийсний дараа түүнээс 1 мл бактерийн уусмал авч, нянгийн эсийг центрифугийн аргаар цуглуулж, уургийн илэрхийлэлд янз бүрийн IPTG концентрацийн нөлөөллийг шинжлэхийн тулд SDS-PAGE-д хамруулсан. хамгийн их уургийн илэрхийлэл бүхий IPTG концентрацийг сонгоно.
Туршилтын дараа IPTG-ийн концентраци аль болох их биш болохыг олж мэдэх болно.Учир нь IPTG нь бактерийн эсрэг тодорхой хоруу чанартай байдаг.Концентраци хэтрүүлбэл эсийг мөн устгана;Ерөнхийдөө эсэд уусдаг уураг их байх тусам илүү сайн байх болно гэж найдаж байна, гэхдээ олон тохиолдолд IPTG-ийн концентраци хэт өндөр байвал их хэмжээний нэгдэл үүсэх болно.Бие махбодь, гэхдээ уусдаг уургийн хэмжээ буурсан.Тиймээс IPTG-ийн хамгийн тохиромжтой концентраци нь ихэвчлэн том байх тусмаа сайн биш, харин бага концентрацитай байдаг.
Генийн инженерийн аргаар боловсруулсан омгийг индукцлэх, тариалах зорилго нь зорилтот уургийн гарцыг нэмэгдүүлэх, зардлыг бууруулахад оршино.Зорилтот генийн илэрхийлэлд зөвхөн омгийн өөрийн хүчин зүйл болон экспрессийн плазмид нөлөөлөөд зогсохгүй индукторын концентраци, индукцийн температур, индукцийн хугацаа зэрэг бусад гадаад нөхцөлүүд нөлөөлдөг.Тиймээс ерөнхийдөө үл мэдэгдэх уургийг ялгаж, цэвэршүүлэхийн өмнө тохирох нөхцлийг сонгож, хамгийн сайн туршилтын үр дүнд хүрэхийн тулд индукцийн хугацаа, температур, IPTG концентрацийг судлах нь хамгийн сайн арга юм.
Шуудангийн цаг: 2021 оны 12-р сарын 31