IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) нь β-галактозидазын субстратын аналог бөгөөд өндөр индукцтэй байдаг. IPTG-ийн индукцийн дор индуктор нь дарангуйлагч уурагтай цогцолбор үүсгэж чаддаг тул дарангуйлагч уургийн конформаци өөрчлөгдөж, зорилтот гентэй нэгдэж чадахгүй болж, зорилтот генийг үр дүнтэй илэрхийлдэг. Тэгэхээр туршилтын явцад IPTG-ийн концентрацийг хэрхэн тодорхойлох ёстой вэ? Их байх тусмаа сайн уу?
Эхлээд IPTG индукцийн зарчмыг ойлгоё: E. coli-ийн лактоз оперон (элемент) нь β-галактозидаза, пермеаза, ацетилтрансферазаг тус тус кодчилдог Z,Y, ба A гэсэн гурван бүтцийн генийг агуулдаг. lacZ нь лактозыг глюкоз ба галактоз эсвэл алло-лактоз болгон гидролиздүүлдэг; lacY нь хүрээлэн буй орчин дахь лактозыг эсийн мембранаар дамжуулж, эсэд нэвтрэх боломжийг олгодог; lacA нь ацетил бүлгийг ацетил-КоА-аас β-галактозид руу шилжүүлдэг бөгөөд энэ нь Хортой нөлөөг арилгахад оршино. Үүнээс гадна, үйлдлийн дараалал O, эхлэх дараалал P болон зохицуулагч ген I байдаг. I генийн код нь операторын дарааллын O байрлалд холбогдож чаддаг дарангуйлагч уураг бөгөөд ингэснээр оперон (мета) дарагдаж, унтардаг. Мөн катаболик генийн идэвхжүүлэгч уураг-CAP холболтын хэсгийн холболтын талбай нь P-ийн эхлэлийн дарааллын дээд хэсэгт байрладаг. P дараалал, O дараалал болон CAP холболтын талбай нь хамтдаа lac operon-ийн зохицуулагч хэсгийг бүрдүүлдэг. Генийн бүтээгдэхүүний зохицуулалттай илэрхийлэлд хүрэхийн тулд гурван ферментийн кодчилдог генүүд нь ижил зохицуулагч бүсээр зохицуулагддаг.
Лактоз байхгүй үед лактоз оперон (мета) дарангуйлагдах төлөвт байна. Энэ үед PI промоторын дарааллын хяналтан дор I дарааллаар илэрхийлэгдсэн лактоз дарангуйлагч нь O дараалалтай холбогддог бөгөөд энэ нь РНХ полимеразаг P дараалалтай холбогдохоос сэргийлж, транскрипцийн эхлэлийг дарангуйлдаг; лактоз байгаа үед лактоз оперон (мета)-г өдөөж болно. Энэхүү оперон (мета) системд жинхэнэ өдөөгч нь лактоз өөрөө биш юм. Лактоз нь эсэд орж, β-галактозидазаар катализжиж, аллолактоз болж хувирдаг. Сүүлийнх нь өдөөгч молекулын хувьд дарангуйлагч уурагтай холбогдож, уургийн конформацийг өөрчилдөг бөгөөд энэ нь дарангуйлагч уургийг O дараалал болон транскрипцээс салгахад хүргэдэг. Изопропилтиогалактозид (IPTG) нь аллолактозтой ижил нөлөө үзүүлдэг. Энэ нь бактериудаар задруулдаггүй, маш тогтвортой маш хүчтэй өдөөгч тул лабораторид өргөн хэрэглэгддэг.
IPTG-ийн оновчтой концентрацийг хэрхэн тодорхойлох вэ? Жишээ болгон E. coli-г авч үзье.
Эерэг рекомбинант pGEX (CGRP/msCT) агуулсан E. coli BL21 генийн инженерчлэлийн аргаар гаргаж авсан омгийг 50μg·mL-1 Amp агуулсан LB шингэн орчинд тарьж, 37°C-д хонуулсан. Дээрх өсгөврийг өргөжүүлэх өсгөврийн зорилгоор 1:100 харьцаатай 50μg·mL-1 Amp агуулсан 10 шил 50мл шинэхэн LB шингэн орчинд тарьж, OD600 утга 0.6~0.8 болоход IPTG-г эцсийн концентрацид нэмсэн. Энэ нь 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0ммоль·L-1 байна. Ижил температурт, ижил хугацаанд индукцийн дараа түүнээс 1 мл бактерийн уусмал авч, бактерийн эсүүдийг центрифугээр цуглуулж, SDS-PAGE-д оруулж, уургийн экспрессэд IPTG-ийн янз бүрийн концентрацийн нөлөөллийг шинжилж, дараа нь хамгийн их уургийн экспресстэй IPTG-ийн концентрацийг сонгосон.
Туршилтын дараа IPTG-ийн концентраци аль болох их биш болохыг тогтооно. Учир нь IPTG нь бактерид тодорхой хоруу чанартай байдаг. Концентрацийг хэтрүүлбэл эсийг үхэлд хүргэдэг; ерөнхийдөө эсэд илүү их уусдаг уураг илэрхийлэгдэх тусам сайн гэж найдаж байгаа ч IPTG-ийн концентраци хэт өндөр байх үед их хэмжээний орц үүснэ. Бие махбодь боловч уусдаг уургийн хэмжээ буурдаг. Тиймээс хамгийн тохиромжтой IPTG концентраци нь ихэвчлэн том байх тусам сайн биш, харин бага концентрацитай байдаг.
Генийн өөрчлөлттэй омгийг индукцлэх, тариалах зорилго нь зорилтот уургийн гарцыг нэмэгдүүлэх, зардлыг бууруулах явдал юм. Зорилтот генийн илэрхийлэлд зөвхөн омгийн өөрийн хүчин зүйлс болон плазмидын илэрхийлэл төдийгүй индукторын концентраци, индукцийн температур, индукцийн хугацаа зэрэг бусад гадаад нөхцөл байдал нөлөөлдөг. Тиймээс ерөнхийдөө үл мэдэгдэх уургийг илэрхийлж, цэвэршүүлэхээс өмнө тохирох нөхцлийг сонгож, хамгийн сайн туршилтын үр дүнг авахын тулд индукцийн хугацаа, температур, IPTG концентрацийг судлах нь хамгийн сайн арга юм.
Нийтэлсэн цаг: 2021 оны 12-р сарын 31